背景肠道细菌感染诱发各种胃肠道紊乱。例如，产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC) 通过定殖小肠引起腹泻，导致儿童和婴儿的发病和死亡。细菌分泌的脂多糖（LPS）激活肠上皮细胞（IECs）的免疫反应，诱导产生细胞因子、趋化因子和急性期蛋白。此外，Toll样受体(TLRs)和NF-κB (nuclear factor-κB)通过诱导上皮免疫反应、动员免疫效应细胞和激活适应性免疫系统，在细胞因子和趋化因子的产生中发挥重要作用。有证据表明mRNA m6-甲基腺苷（m6A）修饰与先天免疫有关，但相关机制知之甚少。
浙江大学动科院汪以真院长课题组在Nucleic Acids Research上发表题为“The N6-methyladenosine RNA-binding protein YTHDF1 modulates the translation of TRAF6 to mediate the intestinal immune response”的研究文章。本文通过ETEC感染和LPS刺激模型再现细菌感染后肠上皮细胞的免疫反应。揭示了mRNA甲基化阅读蛋白——YTHDF1，在DDX60的协同作用下，以m6A依赖的方式调节靶基因Traf6转录本的翻译，进而激活NF-κB信号通路，达到调控肠道上皮细胞免疫应答反应的机制。诺禾致源在本研究中承担翻译组Ribo-seq和RNA甲基化的测序分析工作。图1 YTHDF1调节肠道对细菌感染的免疫应答机制样本类型：猪肠上皮细胞系IPEC-J2及Ythdf1、Ddx60基因敲低细胞系，人肠上皮细胞系Caco-2。样本处理：产肠毒素大肠杆菌enterotoxigenic E. coli K88 (ETEC) 感染、LPS刺激。组学技术：Ribo-seq（翻译组），RNA甲基化。
ETEC感染/LPS诱导宿主肠上皮细胞中RNA甲基化水平升高
m6A测序分析以及液质联用检测发现，感染ETEC后肠上皮细胞中m6A水平整体升高。siRNA沉默了一些m6A甲基化修饰相关基因，发现沉默Ythdf1后，能显著提高IPEC-J2细胞在ETEC感染/LPS刺激后的存活率，细胞因子产量下降，预示免疫反应在减弱。图2 YTHDF1介导肠上皮细胞的细菌免疫反应
YTHDF1可靶向调节NF-κB信号通路中Traf6转录本的翻译效率
有报道称YTHDF1的主要作用是以m6A依赖的方式调节mRNA翻译起始效率。Ribo-seq测序分析表明，沉默Ythdf1后，ETEC或LPS诱导IPEC-J2细胞的翻译效率下降，尤其表现在含m6A修饰的转录本中。NF-κB信号通路为差异显著富集通路。其中的Traf6基因的转录组本水平无显著差异，但翻译效率和蛋白水平显著下降。图3 YTHDF1靶向调节NF-κB信号通路中TRAF6转录本的翻译效率
YTHDF1以m6A依赖的方式调节Traf6基因转录本的翻译效率
RNA甲基化测序分析发现，Traf6转录本甲基化水平在ETEC感染后显著升高。其甲基化peaks主要分布在三个位置：临近翻译终止位点的CDS区两个peaks，3'UTR区域一个peak。接下来，借助携带1-3个Traf6 m6A位点突变质粒的Traf6 KO IPEC-J2细胞，研究YTHDF1对靶向转录本甲基化位点的依赖性。结果发现，当Traf6转录本存在至少一个甲基化位点时，LPS刺激即可诱导TRAF6大量积累。而当Traf6转录本无甲基化位点时，其翻译过程受损，无TRAF6蛋白检出。由此推论，细菌感染诱发的免疫应答过程中，Traf6转录本翻译终止位点周边的m6A位点（无论CDS区还是3’URT区）可调节其翻译过程。图4 YTHDF1依赖于m6A甲基化调节Traf6转录本翻译效率
小鼠模型中，ETEC感染致使结肠和空肠中细胞m6A水平整体升高。表明m6A在肠道对细菌感染的免疫应答反应中起到关键作用。在生物学水平上，含有m6a的核苷酸在功能上是由甲基转移酶、去甲基化酶和阅读蛋白的协调活性介导的。其中阅读蛋白YTHDF1通过与翻译起始因子相互作用，促进核糖体加载，从而加速其靶向转录本的翻译。Ribo-seq和RNA甲基化分析发现，在IPEC-J2细胞中敲除Ythdf1大大降低了包含m6A转录本的翻译效率。在作者关注的NF-κB信号通路中，Traf6转录本的翻译效率变化最为显著。由此推测，Traf6转录本是YTHDF1的一个重要靶向调控对象。YTHDF1协同DDX60以m6A依赖的方式，驱动Traf6转录本的翻译，进而激活TF-κB信号通路。这些发现为肠上皮细胞免疫反应的分子机制提供了新的见解，并为治疗肠道细菌感染提出了新的治疗策略。Zong X, Xiao X, Shen B, et al. The N 6-methyladenosine RNA-binding protein YTHDF1 modulates the translation of TRAF6 to mediate the intestinal immune response[J]. Nucleic acids research, 2021, 49(10): 5537-5552.